Diego Abatantuono nasce il 20 maggio 1955 a Milano, presso il quartiere popolare del Gianbellino (periferia sud-ovest). Il padre Matteo, di origine pugliese (Vieste), è calzolaio; la madre Rosa è milanese, e lavora come addetta al guardaroba al Derby, storico locale meneghino (di proprietà degli zii), prima circolo jazz, poi teatro di cabaret, trampolino di lancio di molti nomi e volti noti dello spettacolo italiano.
La storia di Diego Abatantuono è così legata a questo locale perchè fin da piccolo ha l'opportunità di frequentarlo; gli scarsi risultati scolastici portano il giovane Diego a cercare presto un lavoro. Lo zio lo introduce al Derby come addetto alle luci e direttore di scena: così, da assiduo spettatore Diego diviene un membro del club a tutti gli effetti ed entra in contatto con i cabarettisti; tra gli altri a quel tempo vi erano Massimo Boldi, Teo Teocoli, Gianfranco Funari e Enzo Jannacci.
Per divergenze di opinioni con lo zio, nel 1972 Diego lascia il locale. Torna nel 1975 al Derby come direttore artistico e si trova ad esibirsi sul palco con il suo primo ruolo di "terruncello", bullo dall'accento pugliese trapiantato a Milano.
Il suo lavoro nello spettacolo continua e nei primi anni '80 inizia una collaborazione con "I Gatti di Vicolo Miracoli", con i quali sbarca al cinema con il film "Arrivano i Gatti" (1980). Partecipa inoltre, con Massimo Boldi, Mauro Di Francesco e Giorgio Faletti ad uno spettacolo comico dal titolo "La tappezzeria", che verrà poi ripreso in TV nel programma "Saltimbanchi si muore". La sua caratterizzazione del "terruncello" riscuote grande successo: Renzo Arbore lo vuole nel cast di uno dei suoi film più irriverenti e dissacranti, "Il Pap'occhio" (1980), con uno strepitoso Roberto Benigni.
Trasferitosi a Roma, Abatantuono organizza lo spettacolo "Cane di Puglia"; qui viene notato da Carlo Vanzina.
Dopo "Fantozzi contro tutti", "Una vacanza bestiale", "Fico d'India" (1980) e soprattutto "I fichissimi "(1981), suo primo film da protagonista, s'impone come personaggio di larga presa popolare: il suo trapiantato pugliese, torvo e dirompente, dalla parlata imbastardita, duro ma in fondo pulito diventa un fenomeno di costume.
Diego Abatantuono si dedica anche al teatro: è apprezzata soprattutto l'interpretazione nel "Don Giovanni" di Moliére, per la regia di Franco Morini, del 1984.
Nel 1986 torna al cinema, diretto da Pupi Avati in "Regalo di Natale", in cui interpreta una per lui nuova tipologia di personaggio. Recita in modo convincente ed efficace il ruolo drammatico del personaggio dell'esercente cinematografico credulone, che già pieno di debiti perde al gioco, beffato dagli amici di un tempo. Questa esperienza costituisce una sorta di felice secondo esordio, e che consentirà all'attore di misurarsi con soggetti sempre più impegnativi e autori più esigenti.
Con il regista e caro amico Gabriele Salvatores fonda la casa di produzione cinematografica "Colorado Records", ma soprattutto un sodalizio artistico che produrrà straordinari risultati, il più noto dei quali è sicuramente l'Oscar del 1992 ricevuto per "Mediterraneo", nella categoria Miglior film straniero. Con Salvatores partecipa ai film "Marrakech express" (1989), "Turné" (1990), "Mediterraneo" (1991), "Puerto Escondido" (1992), "Nirvana" (1996), "Amnesia" (2002), "Io non ho paura" (2002).
Altri film tra i più noti: "Camera da letto", "Il testimone dello sposo", "Nel continente nero" (1992, di Marco Risi), "Il barbiere di Rio" (1996), "Metronotte" (2000), "La rivincita di Natale" (2003, sequel di "Regalo di Natale di Pupi Avati).
La carriera di Diego Abatantuono passa anche per la televisione: oltre che in qualità di conduttore ("Italia Mia"), figura nel cast dello sceneggiato "Il segreto del Sahara" di Alberto Negrin nel 1987, e nei panni del commissario Corso nella serie "Notte di luna" di Alberto Sironi.
Nel 2004 conduce e lancia, insieme al caro amico Ugo Conti, su Italia 1 il programma di cabaret "Colorado Café Live".
Nel dicembre 2005 è il personaggio principale della serie televisiva "Il giudice Mastrangelo", con Amanda Sandrelli.
Nel 2006 Diego Abatantuono torna al cinema con il film "Eccezzziunale... veramente - Capitolo secondo... me" che riprende il suo vecchio personaggio Donato, ex capo tifoso milanista.